基于表面增强拉曼光谱技术的贝类中冈田酸快速高灵敏检测研究

1. 引言

1.1 研究背景

1.1.1 冈田酸的性质与危害

• 冈田酸是一种聚醚海洋毒素，主要存在于海洋软体动物的消化腺中。
• 摄入被污染的贝类后，冈田酸会严重威胁人类的健康，可能引起恶心、呕吐和腹泻等胃肠功能障碍症状。
• 除了腹泻性贝类中毒以外，冈田酸还会对人类和动物造成其他严重伤害，如细胞形态和功能的改变以及细胞死亡。

1.1.2 检测方法概述

• 传统的冈田酸检测方法包括小鼠试验法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、酶联免疫法（ELISA）等。
• 然而，这些方法成本高、手续复杂，因此，开发低成本、简便的冈田酸检测方法至关重要。

1.1.3 表面增强拉曼光谱技术（SERS）的优势

• SERS技术是一种新兴技术，基于吸附在金/银粗糙表面或纳米结构上的目标分子官能团的增强拉曼散射，具有高灵敏度、特异性强、速度快等特点。
• 金纳米颗粒具有良好的化学稳定性，不易氧化，且形状和大小相对容易控制。
• 银纳米颗粒的表面增强拉曼光谱增强效果要比金高出100-1000倍，但银纳米颗粒容易氧化，稳定性不如金纳米颗粒。

1.2 研究目的与意义

1.2.1 研究目的

• 建立基于SERS技术的适配体传感器，用于检测贝类中的冈田酸。
• 通过优化实验条件，提高检测的灵敏度和选择性。

1.2.2 研究意义

• 提高食品安全，保护消费者健康。
• 为现场快速检测提供有力解决方案。
• 推动SERS技术在食品安全检测领域的应用和发展。

2. 实验部分

2.1 材料与试剂

2.1.1 主要试剂

• 四氯金酸-4H2O、柠檬酸三钠二水合物、硝酸银、L-抗坏血酸、甲醇、氯化钠、三磷盐酸盐、6-巯基-1己醇、DNA等。
• 所有试剂均为分析级别，所有实验用水均是超纯水，在室温下进行实验。

2.1.2 实验仪器与设备

• 超纯水机、紫外可见分光光度计、拉曼光谱检测仪、Zeta仪器、Unique-R20+UV、UV1920 UV-Vis、RSM1000、Nano ZS90等。

2.2 Ag@AuNPs传感器的制备

2.2.1 AuNPs的制备

• 取0.05 g/ml 的氯金酸母液 100 μL，加入 49.9 ml纯水配成 0.01 %的氯金酸溶液。
• 加热至沸腾后，在剧烈搅拌下迅速加入600 μL柠檬酸三钠溶液（ 1 %）。
• 溶液在十几秒内由深蓝色转变为酒红色，继续加热 15 min 后冷却至室温。
• 将合成的金纳米由超纯水洗涤几次后，与 4 ℃下储存备用。

2.2.2 在金纳米表面修饰HS-DNA

• 将 3 μL的cDNA与 3 μL的5 mM的TCEP混合，在室温中孵育 1 小时。
• 然后在该溶液中加入 3 ml AuNPs，再加入 40 μL 0.1 M的NaCl溶液并在 120 rpm 25 ℃下孵育 24 h。
• 通过Au与末端巯基之间的共价键将DNA固定在AuNPs上，然后再加入 30 μL的10 μM的 6-巯基-1-己醇占据AuNPs表面的剩余的吸附位点。
• 接着将未结合的化学物质和DNA链在 4200 rpm离心40 min后去上清，并在3 ml纯水中重悬。

2.2.3 制备Au@AgNPs传感器

• 将制备好的AuNPs-DNA复合物与 60 μL 0.01M的抗坏血酸混合，在搅拌下缓慢加入0.01 M的硝酸银。
• 观察到溶液的颜色慢慢变为橙色，表明形成了银壳，等待30分钟后然后将3 μL 100 μM的适配体添加到有DNA固定的Au@AgNPs中。
• 使得适配体与DNA相互连接，为了制备双链DNA固定Au@AgNPs，将混合物加热至95 ℃ 5 min，然后在水浴中缓慢冷却至室温。
• 冷却后的混合物在4200 rpm离心 40 min，以去除多余的适配体与其他化学物质，最后重悬于少量纯水中。

2.3 实验方法

2.3.1 可行性分析

• 为了研究整个体系未添加OA与添加OA时的拉曼光谱强度的差异，首先准备两个离心管，一个按照比例1:1添加500 ng/ml OA与Au@AgNPs传感器作为对照组，另一个按照比例 1：1 添加纯水与Au@AgNPs传感器作为空白组。
• 混合完成后反应一段时间，将混合完成后的溶液移取至拉曼光谱检测仪处，在波长为785 nm功率为200 mv 积分时间为 5000 ms 下检测在1196，1396，1471，1591 cm-1处峰值的变化。

2.3.2 盐溶液浓度的优化

• 向与孵育了一小时的AuNPs-DNA复合物中分别加入浓度0.01 M、0.02 M、0.03 M、0.04 M、0.05 M、体积均为40 μL的NaCl溶液。
• 完成适配体的合成后将溶液移取至拉曼光谱检测仪处，在波长为785 nm功率为200 mv 积分时间为5000 ms下测定在1196，1396，1471，1591 cm-1处的拉曼光谱强度。
• 并绘制浓度优化曲线表，选定最佳浓度。

2.3.3 硝酸银用量优化

• 向制备好的3 ml AuNPs-DNA复合物与60 μL 0.01M的抗坏血酸混合，分别加入30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL的浓度为0.01 M 的硝酸银。
• 完成适配体的合成后将溶液移取至拉曼光谱检测仪处，在波长为785 nm功率为200 mv 积分时间为5000 ms下测定在1196，1396，1471，1591 cm-1处的拉曼光谱强度。
• 并绘制浓度优化曲线表，选定最佳浓度。

2.3.4 孵育时间的优化

• 向已经制备好的传感器按照比例1：1与10 ng/ml的OA混合，按照时间0，10，20，30，40，50 min 的时间梯度来进行孵育。
• 将溶液移取至拉曼光谱检测仪处，在波长为785 nm功率为200 mv 积分时间为5000 ms下测定在1196，1396，1471，1591 cm-1处的拉曼光谱强度。
• 并绘制浓度优化曲线表，选定最佳时间。

2.3.5 标准曲线的制备

• 首先配置浓度为500 ng/ml 、100 ng/ml、50 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml、0.1 ng/ml的OA溶液。
• 将所制备的Au@AgNPs传感器与各个浓度的OA按照1：1的比例混合，反应一段时间后将溶液移取至拉曼光谱检测仪处。
• 在波长为785 nm功率为200 mv 积分时间为5000 ms下测定在1196，1396，1471，1591 cm-1处的拉曼光谱强度。
• 并绘制标准曲线表。

2.3.6 特异性分析

• 为了证明这种方法的特异性，在最佳条件下选择了三种其他可能存在于贝类生长环境中的毒素分别是DTX-1、Micro-LA、Micro-LR。
• 将毒素与适配体进行1：1的比例混合，OA的浓度为1 ng/ml，其余毒素的浓度均为 100 ng/ml，混合完成后将溶液移取至拉曼光谱检测仪处。
• 在波长为785 nm功率为200 mv 积分时间为5000 ms下测定在1196，1396，1471，1591 cm-1处的拉曼光谱强度。

2.3.7 稳定性分析

• 为了检查这种方法的稳定性，在最佳条件下合成了十批传感器，并将所有传感器按照比例为