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蜜蜂共生菌质粒转染研究

1. 研究背景与意义

1.1 蜜蜂肠道微生物的重要性

1.1.1 蜜蜂肠道微生物的组成与功能

• 蜜蜂肠道微生物对宿主的健康和生理机能至关重要，可以促进宿主降解有毒物质、吸收多糖、刺激免疫反应。
• 蜜蜂肠道微生物菌群的研究越来越引起人们的关注，因为它们与宿主之间存在长期的协同进化关系。
• 肠道微生物的相对丰度随着菌群定植的完成表现出差异，在幼虫到蛹和成年蜜蜂的变态发育过程中，肠道菌开始正常的定植。

1.1.2 蜜蜂肠道核心菌种Snodgrassella alvi

• S. alvi是蜜蜂肠道核心菌种之一，其主要存在于蜜蜂肠道后段的结肠内壁上。
• 在同一菌种内，不同的蜂种个体会携带不同的菌株，并且个别特定的宿主会有特定的菌株。
• S. alvi菌作为蜜蜂肠道微生物核心菌群之一，深入参与蜜蜂的消化、营养吸收和新陈代谢。

1.2 基因转移技术在肠道微生物研究中的应用

1.2.1 基因转移技术的种类与原理

• 基因转移技术包括病毒载体基因转移和非病毒载体基因转移，在非病毒载体基因转移包括化学和物理方法。
• 电穿孔是一种高效简便的基因转移系统，该方法是使得细胞膜在高压电脉冲作用下出现微小孔，致使细胞吸收外界生物分子。
• 重组后的基因在经过一系列的复制、转录、翻译过程后可以表达出部分载入的体外基因的特点。

1.2.2 基因转移技术在肠道微生物研究中的重要性

• 基因转移技术可以用来研究肠道微生物与宿主之间的相互作用，如共生菌介导RNA干扰体系。
• 通过基因转移技术，可以探索S. alvi改造的可行性，进而深入理解肠道微生物与宿主之间的相互作用。

2. 研究内容与方法

2.1 蜜蜂肠道菌的分离

2.1.1 材料来源

• 实验蜜蜂均来源于江西农业大学蜜蜂研究所中蜂场内的东方蜜蜂（Apis cerana）。
• 在中蜂场中随机捕获10只采集蜂样本，解剖回肠部分，进行肠道菌S. alvi的分离。

2.1.2 肠道菌的分离纯化

• 解剖每只蜜蜂回肠组织，分别在200μL的MgSO4 溶液（10mM）充分研磨得到组织研磨原液。
• 使用PBS缓冲液将组织研磨原液稀释至不同浓度，在哥伦比亚血平板上进行涂布，37℃、5% CO2培养三天。
• 挑单菌落分离纯化两次，获得纯菌。

2.1.3 S. alvi的鉴定

• 使用细菌通用16S引物扩增分离纯化的纯菌DNA，产物送样进行一代测序及比对工作。

2.2 S. alvi 菌质粒转染

2.2.1 实验材料

• 实验使用质粒载体编号为PBTK520，质粒带有绿色荧光标记基因以及大观霉素抗性基因。
• 实验使用S. alvi为前期中蜂中分离纯化的S. alvi。

2.2.2 S. alvi 感受态细胞的制备及电转染操作步骤

• 在哥伦比亚血平板中活化S. alvi；
• 在哥伦比亚液体培养基中接种S. alvi，37℃、5%CO2培养三天；
• 将液体培养基中的细菌使用7000rpm，10min的条件离心下来；
• 使用无菌双蒸水重悬S. alvi，7000rpm，10min离心弃上清液，清洗两遍；
• 将离心后的S. alvi沉淀重悬在10%甘油中，每100μL分装；
• 将100μL S. alvi同500ng质粒载体均匀混合，冰上孵育20min；
• 将75μL混合液转移至2mm电转杯中，使用固定程序“Ec3”进行电刺激；
• 电击后立刻加入900μL哥伦比亚液体培养基，37℃、5%CO2过夜培养；
• 过夜培养后，7000rpm，10min离心沉淀，再次将其重悬在100μL液体培养基中，在带大观霉素的哥伦比亚血平板上涂布，37℃，5%CO2培养三天。

2.3 S. alvi菌定植效果试验

2.3.1 试验材料

• 试验所用中蜂为江西农业大学蜜蜂研究所中蜂。
• 实验前提取即将出房的封盖子脾放入恒温培养箱，使用1天内出房的1日龄蜜蜂接种细菌。
• 将30只1日龄出房蜂装在扎好小孔的50ml无菌无酶离心管中，用于感染转染后的S. alvi试验设置三个生物学重复。

2.3.2 试验方法

• 使用带抗性的平板扩培转染后带荧光的S. alvi。
• 将扩培好的细菌样本均匀溶解在无菌水中，使用无菌水将其稀释至OD=2。
• 配备带抗性的50%蔗糖比例的蔗糖水。
• 将稀释好的OD=2的两种细菌溶液1:1与蔗糖水混匀,30只蜜蜂提供500μL混合液，轻轻摇晃离心管使混合液均匀粘在蜜蜂身体上，经过2小时的自我清理后将蜜蜂转移至常规饲喂杯中。
• 饲喂杯放入恒温箱，每天提供新鲜的混有大观霉素的50%蔗糖水，人工常规饲养。
• 每天计算蜜蜂死亡率并在感染之后的第4、6、8、10天时每杯处死5只蜜蜂，解剖回肠，使用200μL无菌水研磨充分之后，用无菌水将其稀释至不同浓度，在带大观霉素的血平板上涂布，37℃，5%CO2培养3天，计算蜜蜂S. alvi菌CFU数量。

3. 研究结果与讨论

3.1 研究结果

3.1.1 S. alvi菌的鉴定

• 从S. alvi菌的鉴定结果可以看出，每个蜜蜂样本至少分离纯化出一个S. alvi菌株，共10个S. alvi菌株。
• 实验结果表明，S. alvi菌可以作为工程菌在蜜蜂肠道中传递效应dsRNA，可以显著抑制蜜蜂中肠微孢子虫的繁殖量。

3.1.2 S. alvi菌质粒转染

• 转染试验中，我们计算了每个蜜蜂个体回肠组织中定植下来的S. alvi菌株数量。
• 在接种S. alvi菌株第4天和第6天时，该菌株在中蜂回肠中表现出最高的繁殖量，在之后的检测时间段中，S. alvi菌株的繁殖量显著减少。

3.2 讨论

• 从S. alvi菌的定植效果可以看出，前6天蜜蜂体内S. alvi菌的定植效果相较于6天之后的定植效果而言，前期的更为稳定且S. alvi菌繁殖量相对较大。
• 从这一结果看，前期与后期的明显差异可能是由于蜜蜂且S. alvi菌质粒的丢失有关。
• 肠道菌群的相对丰度随着菌群定植的完成表现出差异，在幼虫到蛹和成年蜜蜂的变态发育过程中，由于肠内脏会出现脱落，新出房的成年蜜蜂很少或者没有肠道细菌。
• 随着新出房工蜂与蜂巢环境的接触和工蜂的哺育，肠道菌开始正常的定植。
• S. alvi菌作为蜜蜂肠道微生物核心菌群之一，深入参与蜜蜂的消化、营养吸收和新陈代谢。
• 通过基因转移技术，可以探索S. alvi改造的可行性，进而深入理解肠道微生物与宿主之间的相互作用。
• 未来的研究可以进一步探讨S. alvi菌在蜜蜂肠道中的具体作用机制，以及如何利用基因转移技术对S. alvi菌进行更有效的改造，为蜜蜂肠道微生物的研究和应用提供更多的科学依据。