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菜心中BES1/BZR1家族同源基因的克隆及功能分析

1. 引言

1.1 研究背景

1.1.1 菜心的生物学特性

• 菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）是我国南部地区广泛种植的蔬菜作物。
• 菜心富含维生素、矿物质、次生代谢产物和膳食纤维，对人体健康有益。
• 研究菜心的生长发育和环境适应机制，对提高蔬菜产量和品质具有重要意义。

1.1.2 BR信号通路在植物生长发育中的作用

• BR信号通路是植物生长发育的关键调控途径之一。
• BR信号通路参与调节植物的生长发育、分化和抗逆性等多个方面。
• BR信号通路中的关键转录因子BES1/BZR1家族在植物生长发育过程中发挥着重要作用。

1.2 研究目的与意义

• 克隆菜心中BES1/BZR1家族同源基因，分析其功能。
• 探讨BR信号通路在菜心生长发育中的作用机制。
• 为菜心的遗传改良和品种优化提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1 实验材料

• 四九-19菜心、拟南芥Col-0、本氏烟草。
• 克隆载体、过表达载体、报告载体、大肠杆菌宿主菌DH5α、农杆菌GV3101。

2.2 实验仪器与试剂

2.2.1 实验仪器

• 电子天平、低温保存箱、恒温水槽、高速冷冻离心机、PCR仪、振荡培养箱、植物组织培养箱、洁净工作台、高压灭菌锅、酸度计、化学发光图像分析系统、电泳仪、凝胶成像系统、切胶仪、分光光度计、实时荧光定量PCR系统。

2.2.2 实验试剂

• PBS、TAE缓冲液、SDS loading buffer、BL培养基、次氯酸钠、乙醇、丙酮、异丙醇、甘油、Tris pH8.8、Tris pH6.8、SDS、DMSO、ddH2O，Western Lightning® Plus-ECL Enhanced Luminol Reagent, Western Lightning® Plus-ECL Oxidizing Reagent，KOH，琼脂糖凝胶电泳DNA Marker 5 000 bp，核酸染料，Primer STAR MAX Premix，Rapid Taq Master Mix，LB培养基，zeocin抗生素，丙烯酰胺，过硫酸胺，TEMED，质粒提取试剂盒、产物纯化试剂盒、基因组提取试剂盒、RNA提取试剂盒。

2.3 实验方法

2.3.1 BL处理菜心种子

• 使用100 %酒精和70 %酒精清洗种子，然后用1 %次氯酸钠浸泡种子，接着用灭过菌的去离子水清洗，最后加入适量灭菌水，放置室温春化三天。
• 配制MS培养基和BL培养基，将种子点入培养基中，放于培养箱培养。

2.3.2 菜心中BES1/BZR1家族同源基因的获取

• 从tair网站下载拟南芥BES1家族氨基酸序列，通过构建本地菜心blast数据库，进行本地蛋白blast，获取菜心中BES1/BZR1家族基因ID，进而得到对应的基因编码序列。

2.3.3 菜心中BES1/BZR1家族同源基因的克隆

• 提取菜心基因组DNA，PCR扩增，阳性条带产物纯化。构建表达载体，BP反应，转化，涂板，菌落PCR，跑电泳，摇菌，提质粒并测序。LR反应，转化，涂板，菌落PCR，跑电泳，摇菌，提质粒。

2.3.4 利用Western Blotting检测BL处理菜心幼苗后的变化

• 获取生长旺盛、生长态势相似的幼苗，放置于吸水纸上，吸去多余水分。将所有幼苗转移到写有标记的锡纸上，折叠包装，扔到提前装了液氮的泡沫箱。同时将研磨罐、研磨珠、样品转移到低温离心机中，设置4 ℃、12 000 r/min，离心10 min。取上清，进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显影，定影。

2.3.5 利用qRT-PCR验证BL处理后菜心响应基因的变化

• 提取总RNA，反转录为cDNA，进行qRT-PCR反应。分析BL处理后菜心响应基因的表达变化。

2.3.6 利用双荧光素酶报告实验检测菜心中BES1、BZR1对响应基因的转录调控

• 构建双荧光素酶报告载体，瞬时转化烟草，利用双荧光素酶报告系统检测BES1、BZR1对响应基因的转录调控功能。

3. 结果与分析

3.1 BL处理对菜心下胚轴伸长的影响

• BL处理可以显著促进菜心幼苗下胚轴的伸长。

3.2 BL处理菜心幼苗后CxBZR1蛋白磷酸化的变化

• BL处理后，菜心中CxBZR1蛋白的非磷酸化形式明显增多。

3.3 菜心中CxBZR1家族成员分析

• 分析发现菜心中存在11个CxBZR1家族成员。

3.4 菜心中BES1/BZR1家族同源基因的克隆

• 成功克隆了多个BES1/BRZ1家族同源基因，包括BcBES1-20970、BcBES1-37392、BcBES1-47067、BcBES1-62754、BcBES1-68812及BcBES1-120659。

3.5 利用qRT-PCR验证BL处理后菜心响应基因的变化

• BL处理后，菜心中CPD和DWF4等基因的表达显著下调。

3.6 BES1/BZR1家族同源基因驱动下游报告基因表达的功能验证

• 通过双荧光素酶报告实验，验证了BES1/BZR1家族同源基因对下游报告基因的转录调控功能。

4. 讨论

4.1 BR信号通路在菜心生长发育中的作用

• BR信号通路在菜心的生长发育过程中发挥着重要作用。
• BES1/BZR1家族同源基因在BR信号通路中起着关键作用。

4.2 BES1/BZR1家族同源基因的功能分析

• 通过克隆和功能分析，揭示了BES1/BZR1家族同源基因在菜心生长发育中的作用机制。
• BES1/BZR1家族同源基因对下游响应基因的转录调控功能，为菜心的遗传改良和品种优化提供了理论依据。

5. 结论

• 本研究成功克隆了菜心中BES1/BZR1家族同源基因，并对其功能进行了分析。
• 研究结果为深入理解BR信号通路在菜心生长发育中的作用机制，以及菜心的遗传改良和品种优化提供了重要的理论基础。 """