用于数字PCR的多色荧光颜色解析方法研究

1. 数字PCR技术背景

1.1 数字PCR技术概述

1.1.1 数字PCR技术的原理

• 数字PCR（Digital PCR, dPCR）是一种核酸分子的绝对定量技术，通过将待测样本分成数万个微小的反应单元，每个单元至多包含一个核酸分子，然后进行扩增反应，并通过终点检测统计每个反应单元中的阳性与阴性结果，通过泊松分布计算样本的浓度。
• 数字PCR技术通过将PCR反应液分割成大量微小水滴，并分别进行扩增，最终通过分析阳性和阴性水滴比例来测定初始样品中的目标序列的数量。
• 数字PCR具有高灵敏度、高精确度、无需标准品等优点，尤其适合低浓度样本的绝对定量。

1.1.2 数字PCR技术的应用

• 数字PCR在基因表达研究中，可以准确地定量不同基因的表达水平。
• 在肿瘤诊断中，数字PCR可以检测极低浓度的肿瘤标记物，提高早期癌症的检测率。
• 在基因编辑和遗传改造中，数字PCR可以定量检测基因编辑效率和拷贝数变化。

1.2 数字PCR多色检测方法研究现状

1.2.1 基于光电传感器的荧光检测

• 基于光电传感器的荧光检测利用光电二极管（Photodiode）或光电倍增管（Photomultiplier Tube,PMT）等光电传感器来测量荧光信号的强度。
• 这种方法通过将样品中的荧光信号与光电传感器之间的光路直接联系起来，可以实时监测荧光信号的强度变化。
• 2023年，Jatin Panwar提出了一种方法，用于解决多光谱荧光分析中的串扰问题。通过声光调制器调制多束激光光束，并选择性顺序地激发具有特定波长的荧光物质。基于FPGA的数据采集算法与调制信号同步，只采集与给定激发波长对应的荧光通道的发射信号。

1.2.2 基于图像传感器的荧光检测

• 基于图像传感器的荧光检测利用像素阵列传感器来捕捉荧光信号的图像。
• 这种方法将反映荧光信号强度的图像数据传输给计算机进行处理，可以获取更广范围的信息，包括信号分布、空间位置等。
• 2019年Zhou等人提出了一种基于Raspberry Pi的实时数字PCR设备。利用sCMOS（Scientific Complementary Metal-Oxide-Semiconductor）相机在每个PCR循环的退火延伸阶段进行荧光图像采集。通过配备多波段光源和合适的滤光片组，该设备可以实现多重荧光探测。

1.3 课题研究目的及内容

• 数字PCR的多色检测方法可以利用多个光电传感器或图像传感器实现。前者适用于低通量液滴检测，但成本较高；后者适用于高通量液滴检测，但对图像分析要求更高。
• 课题研究目的在于开发一种实时多目标荧光检测方法，提高多色成像通路的同时提高检测效率。
• 研究内容包括：基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法的开发，图像预处理环节的关键步骤，NCI计算和颜色分类的理论基础和实现步骤，以及基于色度sCMOS的多色荧光检测方法在CLH1质粒质粒上的应用。

2. 实验材料与系统构建

2.1 实验试剂与材料

• 实验试剂如表2- 1 所示，包括CLH1质粒、F引物、R引物、FAM探针、ROX探针、Cy5探针、数字PCR预混油、液滴生成油等。
• 在搭建系统前，先制备单色样本。将浓度为微米的质粒样本作为母液，分别做不同梯度浓度稀释，得到模板浓度分为 、、、的质粒样本。
• 然后准备离心管，加入9的F引物和R引物、5的探针（FAM、ROX或Cy5）、77的水配置引物探针溶液。然后取10的数字PCR预混液、1的引物探针、2的质粒以及7水配置数字PCR反应液。

2.2 检测系统搭建

2.2.1 液滴芯片

• 研究中选用了苏州锐讯有限公司的一体式芯片。整张芯片尺寸大小为：60 mm 40 mm，该芯片设计具有4个样本检测通道，每个样本有2个液滴存储腔室，而每个腔室尺寸为：35 mm 4 mm，总共有8个腔室可以供使用。全部腔室反应区域为；40 mm 40 mm，因此能够同时支持4个样本检测。
• 在制备液滴过程中，每个方形进样口加入75液滴生成油，每个圆形进样口加入20样本反应液，盖上盖帽密封。共制备4份不同浓度样本。

2.2.2 温度控制系统设计

• 温度控制系统设计是数字PCR技术中的一个重要环节，其目的是保证PCR反应在适当的温度下进行。
• 温度控制系统设计包括加热模块和温度传感器。加热模块用于提供稳定的加热功率，确保PCR反应温度的一致性。温度传感器用于实时监测反应温度，并通过控制加热功率来维持恒定的反应温度。

2.2.3 荧光检测系统设计

• 荧光检测系统设计是数字PCR技术中的另一个重要环节，其目的是准确检测和分析荧光信号。
• 荧光检测系统设计包括光源、光学滤光片、光电传感器和信号处理模块。光源用于激发荧光分子，产生荧光信号。光学滤光片用于选择特定波长的荧光信号，减少背景噪声。光电传感器用于检测荧光信号的强度。信号处理模块用于对光电传感器采集的信号进行放大、滤波和数字化处理，以便进行后续的图像分析和数据处理。

2.3 检测系统评估

• 检测系统的性能评估包括灵敏度、准确性和重复性等方面的评估。
• 灵敏度评估主要通过检测低浓度样本的定量准确性来评估。准确性和重复性评估主要通过与标准品或参考方法进行比较来评估。

2.4 本章小结

• 实验材料与系统构建是数字PCR技术中的关键环节，包括实验试剂与材料的准备，检测系统的搭建和性能评估。
• 实验试剂与材料的准备需要根据实验需求进行选择和配置。检测系统的搭建需要考虑液滴芯片、温度控制系统和荧光检测系统的设计和优化。性能评估需要通过灵敏度、准确性和重复性等方面的评估来验证系统的性能。

3. 基于色度sCMOS的多色荧光颜色解析方法研究

3.1 引言

• 数字PCR技术在多目标基因检测方面存在多色通量低，检测时间长等问题，从而限制了数字PCR的检测速度。
• 因此，亟需开发一种实时多目标荧光检测方法，提高多色成像通路的同时提高检测效率。

3.2 数据准备

• 数据准备包括荧光图像的采集和预处理。
• 荧光图像的采集需要使用适当的相机和光源，确保图像的质量和稳定性。预处理需要对图像进行去噪、对比度增强和阈值分割等处理，以便后续的图像分析和数据处理。

3.3 图像预处理

• 图像预处理是数字PCR技术中的一个重要环节，其目的是提高图像质量，增强特征信息，便于后续的图像分析和数据处理。
• 图像预处理包括去噪、对比度增强、阈值分割和形态学处理等步骤。去噪可以去除图像中的噪声和干扰信息，提高图像质量。对比度增强可以增强图像中的特征信息，便于后续的图像分析和数据处理。阈值分割可以将图像分割为不同的区域，便于后续的图像分析和数据处理。形态学处理可以对图像进行腐蚀、膨胀、开运算和闭运算等操作，以提取图像中的特定特征。

3.4 NCI计算

3.4.1 理论依据

• NCI（Normalized Color Index）是一种基于颜色特征的图像分析方法，通过计算图像中每个像素的颜色特征与整体图像颜色特征的相似度，来评估图像中的颜色分布和变化。
• NCI计算包括颜色特征提取、颜色特征相似度计算和颜色特征分布分析等步骤。颜色特征提取可以提取图像中的颜色特征，如颜色直方图、颜色矩等。颜色特征相似度计算可以计算图像中每个像素的颜色特征与整体图像颜色特征的相似度。颜色特征分布分析可以分析图像中的颜色分布和变化趋势。

3.4.2 实现步骤

• NCI计算的实现步骤包括：1）图像预处理，包括去噪、对比度增强、阈值分割和形态学处理等；2）颜色特征提取，如颜色直方图、颜色矩等；3）颜色特征相似度计算，计算图像中每个像素的颜色特征与整体图像颜色特征的相似度；4）颜色特征分布分析，分析图像中的颜色分布和变化趋势。

3.5 颜色分类

3.5.1 理论依据

• 颜色分类是数字PCR技术中的一个重要环节，其目的是将图像中的不同颜色荧光信号进行区分和识别。
• 颜色分类包括颜色特征提取、颜色聚类和颜色识别等步骤。颜色特征提取可以提取图像中的颜色特征，如颜色直方图、颜色矩等。颜色聚类可以对颜色特征进行聚类分析，将相似的颜色特征分为同一类别。颜色识别可以识别图像中的不同颜色荧光信号，并进行区分和识别。

3.5.2 实现步骤

• 颜色分类的实现步骤包括：1）图像预处理，包括去噪、对比度增强、阈值分割和形态学处理等；2）颜色特征提取，如颜色直方图、颜色矩等；3）颜色聚类，对颜色特征进行聚类分析，将相似的颜色特征分为同一类别；4）颜色识别，识别图像中的不同颜色荧光信号，并进行区分和识别。

3.6 方法评估

• 方法评估包括定量准确性和速度评估。
• 定量准确性评估主要通过与标准品或参考方法进行比较来评估。速度评估主要通过与传统方法进行比较来评估。

3.7 本章小结

• 基于色度sCMOS的多色荧光颜色解析方法研究是数字PCR技术中的一个重要方向，其目的是提高多色成像通路的同时提高检测效率。
• 数据准备、图像预处理、NCI计算和颜色分类是该方法的关键步骤。通过这些步骤，可以实现对图像中不同颜色荧光信号的区分和识别，提高定量准确性和速度。
• 该方法在数字PCR技术中的应用具有广阔的前景，可以拓展数字PCR技术的应用范围，提高其在多目标基因检测方面的性能。

4. 测试与结果用于CLH1质粒的数字PCR的多色检测

4.1 引言

• 基于色度sCMOS的多色荧光颜色解析方法在CLH1质粒的数字PCR中的应用，可以提高数字PCR技术在检测不同目标序列时的灵敏度和准确性。
• 实验结果可以验证该方法的可行性、高准确性和极大的应用前景。

4.2 实验部分

• 实验部分包括实验试剂与材料的准备，检测系统的搭建和性能评估。
• 实验试剂与材料的准备需要根据实验需求进行选择和配置。检测系统的搭建需要考虑液滴芯片、温度控制系统和荧光检测系统的设计和优化。性能评估需要通过灵敏度、准确性和重复性等方面的评估来验证系统的性能。

4.3 结果与讨论

• 结果与讨论部分主要包括实验结果的展示和分析，以及与传统方法进行比较。
• 实验结果可以验证基于色度sCMOS的多色荧光颜色解析方法在CLH1质粒的数字PCR中的应用的可行性、高准确性和极大的应用前景。与传统方法进行比较，可以进一步证明该方法的优势和应用价值。

4.4 本章小结

• 基于色度sCMOS的多色荧光颜色解析方法在CLH1质粒的数字PCR中的应用，可以提高数字PCR技术在检测不同目标序列时的灵敏度和准确性。
• 实验结果证明了该方法的可行性、高准确性和极大的应用前景。

5. 总结与展望

• 数字PCR技术是生命科学中一种重要的分子生物学工具，其在多目标基因检测方面存在多色通量低，检测时间长等问题，从而限制了数字PCR的检测速度。
• 基于色度sCMOS的多色荧光颜色解析方法是一种实时多目标荧光检测方法，可以提高多色成像通路的同时提高检测效率。
• 该方法在数字PCR技术中的应用具有广阔的前景，可以拓展数字PCR技术的应用范围，提高其在多目标基因检测方面的性能。
• 未来研究方向包括进一步提高该方法的定量准确性和速度，以及与其他数字PCR技术进行结合，实现更高效的多目标基因检测。