利用野油菜黄单胞菌制备纳米农药的研究

1. 引言

1.1 研究背景

1.1.1 核桃和黄瓜的种植现状

• 核桃和黄瓜在全国范围内广泛种植，是我国重要的经济作物。
• 然而，它们在生长过程中容易受到野油菜黄单胞菌和丁香假单胞杆菌黄瓜致病变种的影响，导致产量和品质显著下降。

1.1.2 传统农药的局限性

• 长期使用传统农药会使得致病细菌产生抗药性，降低抑菌效果。
• 此外，传统农药的使用也会对环境和人类健康造成负面影响。

1.2 纳米农药的优势

1.2.1 提高农药利用率

• 纳米农药由于其独特的物理性质，可以提高农药在作物中的溶解度和附着性，从而提高农药的利用率。
• 纳米农药还能更精准地与作物中的致病微生物接触，更专一地发挥药效。

1.2.2 减少抗药性的产生

• 纳米农药能够通过物理损伤、氧化应激等方式抑制细菌生物膜的生长，从而减少抗药性的产生。
• 纳米农药的缓释特性也有助于延长药效，减少用药次数，从而降低抗药性的风险。

2. 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试菌株

• 野油菜黄单胞菌、丁香假单胞杆菌黄瓜致病变种。
• 菌株由天津农学院植物病理实验室提供。

2.1.2 供试培养基

• Luria-Bertani培养基（LB）。

2.1.3 主要试剂

• 春雷霉素（Kasugamycin，KSM）、聚酰亚胺（PI）。

2.1.4 主要仪器

• 纳米粒度及Zeta电位分析仪、冷冻离心机、高压灭菌锅、酶标仪等。

2.2 方法

2.2.1 菌株活化

• 将野油菜黄单胞菌和丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病菌转接于LB培养基中，37°C培12h，收集单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，以220 rpm震荡过夜，生长至OD值0.6-1.00。

2.2.2 纳米粒子制备

• 将OD值0.6-1.00的菌悬液以4000 rpm，2 min离心细菌，弃上清，用无菌水将沉淀清洗2-3次，取沉淀称重。
• 将菌体按照干重1:20加入相应体积的无菌水，冰浴条件下用超声探头破碎30s停止30s，功率40%，循环6 min。将破碎后的液体离心1000 rpm，2 min取上清液。按照干重1：2的比例加入聚酰亚胺震荡，以空白为对照。在上述溶液中按照菌体干重5：1加入一定量春雷霉素，剧烈混匀，静置1小时。使用时超声状态下稀释，所得溶液即为细菌碎片-春雷霉素纳米溶剂。

2.2.3 微量肉汤稀释法

• 最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)是指在18~24小时的细菌体外培养之后，对培养基内病原菌的生长具有抑制作用的最小的药剂浓度，是用于评价抗菌剂的抑菌效果的程度的参数。
• 对数期野油菜黄单胞菌和丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病菌稀释菌液分别与不同终浓度的药物(512、256、64、16、4、1 μg/mL)在96孔板中进行培养，每孔中的菌液浓度大约为107CFU/mL。
• 没有用药物处理的细菌孔作为细菌对照组；不含细菌的的药物培养基溶液组作为参比对照用于扣除药物吸收的影响；每个实验组至少设置3个平行孔。
• 将96孔板放置于37℃培养箱中培养9小时，取出后用酶标仪测量600nm的吸光度。

2.2.4 结晶紫染色法

• 向96孔细胞培养板中加入100 μL菌悬液（OD600=0.6）和100 μL液体LB培养基，置于5%二氧化碳、37℃细菌培养箱中静置培养24 h，待长出生物被膜后吸出100 μL的培养基，给药组每孔加入50 μL的经PI处理的的纳米复合药物（浓度为7.8125μg/mL）和同浓度的春雷霉素，对照组加入50 μL的无菌水，培养12小时。
• 然后吸出96孔板中的液体，用无菌的PBS(pH=7.4)清洗3次，目的是去除浮游菌体，然后在室温下加入150 μL1%甲醇-结晶紫溶液，染色20 min后将甲醇-结晶紫溶液移除，用无菌的PBS清洗3次，以除去未与生物膜结合的染料，然后将96孔板置于55℃烘箱中直至完全干燥为止。
• 干燥完成后向96孔板中加入200 μL的95%乙醇溶液，轻轻震荡使结晶充分溶解，吸取适量的结晶紫-乙醇溶液用酶标测仪测量590 nm下的吸光度。

3. 结果与分析

3.1 数据分析

• 试验数据以P<0.05表示差异显著，采用SPSS进行显著性分析和数据处理。数据用平均值±标准偏差(means+SD)表示。
• 利用Origin2021等进行作图,所有处理均设置3次重复。

3.2 结果与讨论

3.2.1 纳米农药的抑菌效果

• 实验结果表明，负载春雷霉素的野油菜黄单胞菌纳米粒子的平均粒径为102.7nm。
• 在相同浓度（512、256、64、16、4、1μg/mL）下，纳米农药的抗细菌效果明显优于传统抗生素。
• 添加表面活性剂和无任何添加的载药体系并无显著性差异。
• 纳米农药对已形成的生物膜也有一定影响。

3.2.2 纳米农药的生物膜抑制效果

• 实验结果显示，纳米农药对细菌生物膜的抑制效果显著。
• 纳米农药能够通过物理损伤、氧化应激等方式抑制细菌生物膜的生长，从而减少抗药性的产生。
• 纳米农药的缓释特性也有助于延长药效，减少用药次数，从而降低抗药性的风险。

4. 结论

• 本研究利用超声破碎法制备载药野油菜黄单胞菌纳米粒子，构建以其为基础负载春雷霉素的纳米农药体系，对其理化性能进行表征，通过微量肉汤稀释法和结晶紫染色法测定其对病原菌的抑菌活性。
• 实验结果表明，负载春雷霉素的野油菜黄单胞菌纳米粒子的平均粒径为102.7nm，在相同浓度下，纳米农药的抗细菌效果明显优于传统抗生素。
• 纳米农药对已形成的生物膜也有一定影响。
• 本研究为核桃黑斑病和黄瓜细菌性角斑病的绿色、高效和安全防控提供了新的解决方案，在防治植物病害方面具有广泛的应用前景。