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苹果根腐病防治药剂的室内筛选

1. 研究背景

1.1 苹果根腐病的危害

1.1.1 苹果根腐病的症状

苹果根腐病主要表现为根部腐烂、根毛减少、根系生长受阻等症状。
受感染的苹果树根系逐渐变黑，并出现腐烂现象，导致树体生长不良。
根腐病会影响苹果树的养分吸收和水分运输，导致树势衰弱，严重时可导致死亡。

1.1.2 苹果根腐病的病原菌

苹果根腐病的病原菌主要包括核盘菌属（Sclerotium sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）、座坚壳属（Rosellinia sp.）、蜜环菌属（Armillaria sp.）和疫霉属（Phytophthora sp.）等。
病原菌Dactylonectria sp.及土赤壳属（Ilyonectria sp.）是近年来新发现的病原菌，对苹果树具有较高的致病性。

1.2 苹果根腐病的防治方法

1.2.1 农业防治

选用无病苗木，避免病原菌的传播。
合理轮作，降低病原菌的积累。
加强土壤管理，提高土壤的有机质含量。
避免过度施肥，特别是氮肥，以免导致树体生长过旺，降低树体的抗病能力。

1.2.2 化学防治

采用化学药剂进行防治是苹果根腐病防治的重要手段之一。
常用的化学药剂包括甲基硫菌灵、多菌灵、苯醚甲环唑等。
化学药剂的使用应根据病原菌的种类和药剂的特性进行合理选择，避免长期使用同一类药剂导致病原菌产生抗药性。

1.3 室内药剂筛选的重要性

室内药剂筛选是苹果根腐病防治研究的重要组成部分。
通过室内药剂筛选，可以筛选出对病原菌具有较高抑制效果的药剂，为田间防治提供科学依据。
室内药剂筛选还可以为药剂的合理使用提供指导，降低药剂的滥用和环境污染。

2. 材料与方法

2.1 供试材料

供试菌株：病原真菌1Y-HQI-17，1Y-HQI-37，1Y-HQI-39，1Y-HQI-40，2-HQ-B-2，由甘肃省农业科学院植物保护研究所经济作物病害研究室在2021-2023年从甘肃天水、平凉、庆阳等苹果幼苗根腐病发病植株上分离，甘油保存于-80℃超低温冰箱。
供试培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g加水至1000 mL，于121℃湿热灭菌30 min。
供试杀菌剂：供试的5种杀菌剂名称、设置浓度及生产厂家见表1。

2.2 试验方法

2.2.1 苹果根腐病病原菌的形态学观察

将病原菌置于PDA培养基平板上置于 25 ℃黑暗培养7 d后，观察并记录菌落的形态特征。
菌落形态特征包括菌落的大小、颜色、边缘形态、气生菌丝的生长情况等。

2.2.2 苹果根腐病病原菌分子生物学鉴定

基因组DNA的提取：采用CTAB法提取基因组DNA，具体步骤包括研磨菌丝、提取DNA、PCR扩增等。
PCR扩增及扩增产物测序：选取引物ITS1/4，CYLH3F/CYLH3R和T1/CYLTUB1R进行3个基因片段的PCR扩增，序列见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。
序列分析：将测序所得序列在NCBI中进行BLAST比对后，初步明确菌株种属，用MEGA 7.0软件进行多序列比对，采用Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

2.2.3 5种药剂的室内毒力测定

药剂室内毒力测定采用菌丝生长速率法进行测定。将供试菌株在PDA培养基上25℃培养7 d后，在接近菌落边缘生长一致的地方用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，分别接入含不同浓度杀菌剂的PDA培养基平板中央，每种杀菌剂均设5个不同的浓度梯度（表6），以不含药的PDA培养基为空白对照，每个处理3次重复，置于25℃恒温培养箱培养，第8天采用十字交叉法量取菌落直径，计算不同药剂下菌丝生长抑制率。
数据处理：根据杀菌剂浓度的对数值（x）和抑菌生长率的几率值（y）建立回归方程y=ax+b，采用spss.17数据处理软件计算得到相关系数R和致死中浓度（EC50）。根据EC50分析比较不同杀菌剂对供试病原菌的毒力。

3. 结果与分析

3.1 苹果根腐病病原菌形态学观察

菌株1Y-HQI-17在PDA培养基上25℃培养7 d，生长较为缓慢，菌落圆形，菌落由内向外由白色渐变至米黄色，菌落直径为40.20±0.54mm；气生菌丝滑顺，菌丝有隔膜。
菌株1Y-HQI-37在PDA培养基上25℃培养7 d，生长较为缓慢，菌落圆形，菌落由内向外由米白色渐变至白色，菌落直径为45.50±0.43mm；气生菌丝滑顺，菌丝有隔膜。
菌株1Y-HQI-39在PDA培养基上25℃培养7 d，生长较为缓慢，菌落圆形，菌落由内向外由米白色渐变至白色，菌落直径为45.25±0.34mm；气生菌丝很短，呈毡绒状，幼嫩时白色，后变成棕黄色。
菌株1Y-HQI-40和2-HQ-B-2在PDA培养基上25℃培养7 d，生长较为缓慢，培养初期边缘呈乳白色絮状绒毛状，菌落由外向内从米黄色渐变至褐黄色，整体呈毡状，菌落直径为45.25±1.34mm；气生菌丝滑顺，菌丝无色有隔。

3.2 苹果根腐病病原菌分子系统发育分析

通过ITS基因序列分析，将苹果幼苗根腐病病原菌1Y-HQI-17、1Y-HQI-37、1Y-HQI-39和1Y-HQI-40鉴定为Dactylonectria torresensis。
菌株2-HQ-B-2被鉴定为Ilyonectria robusta。

3.3 5种药剂的室内毒力测定

11%精甲·咯·嘧菌种子处理悬浮剂对供试的两类病原菌抑制效果最好，EC50值的范围为8.5437~45.4510 µg·mL-1。
20%丁子香酚、35%啶酰·氟菌唑、40%烯酰吗啉和25g·L-1咯菌腈对供试病原菌的抑制效果较差。

4. 结论与讨论

4.1 结论

苹果幼苗根腐病的病原菌主要包括Dactylonectria torresensis和Ilyonectria robusta。
11%精甲·咯·嘧菌种子处理悬浮剂对供试的两类病原菌具有较好的抑制效果，可以作为苹果根腐病的防治药剂。

4.2 讨论

苹果根腐病的病原菌种类较多，不同地区和不同品种的苹果树可能感染的病原菌种类不同，因此在防治过程中需要根据实际情况进行有针对性的防治。
化学药剂的使用应遵循科学合理的原则，避免长期使用同一类药剂导致病原菌产生抗药性。
综合采用农业防治和化学防治的方法，可以有效降低苹果根腐病的发生和传播。

5. 参考文献

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