双翅六道木中果胶的提取及表征

1. 双翅六道木与果胶

1.1 双翅六道木的特征

1.1.1 双翅六道木的生物学特征

双翅六道木（Premna microphylla Turcz）属于忍冬科植物，是落叶灌木。
叶子卵形，顶端渐尖，底部楔形或钝形，边缘是稀疏锯齿状。
花为红色的花冠，主要生长在陕西、湖北等地。

1.1.2 双翅六道木的药用价值

双翅六道木嫩叶中的蛋白质、脂肪、粗多糖、果胶、钾、钙、铁、锌、硒、泛酸、β-胡萝卜素、烟酸含量均较高。
锌和硒有助于提高人体免疫力及增强记忆力。
双翅六道木的嫩叶当中含有多种氨基酸，其中以谷氨酸含量最高，具有较高的营养价值。

1.2 果胶的特性与应用

1.2.1 果胶的定义与分类

果胶是一种主要由D-半乳糖醛酸（D-Galacturonic Acids，D-Gal-A）通过α-1,4-糖苷键连接组成的酸性杂多糖。
果胶在植物中主要存在于细胞壁和细胞内层，尤其在柑橘、柠檬、柚子等水果的果皮中含量较高。
果胶的分类主要基于其酯化度，分为高酯果胶和低酯果胶。

1.2.2 果胶在食品工业中的应用

果胶在食品工业中常被用作增稠剂、稳定剂和乳化剂，用于制造果酱、果冻、酸奶等食品。
果胶因具有出色的凝胶、增浓、稳定和悬浮能力，获得了广泛的应用和赞誉。
果胶被广泛应用在多种食品中，如果冻、果酱、糖果、酸奶、饮料以及罐头等，是以上食品中至关重要的成分。

1.3 双翅六道木果胶的研究现状

1.3.1 双翅六道木果胶的提取方法

果胶的提取方法主要包括传统热水提取法、酸提取法、酶提取法、超声波辅助提取法等。
近年来，超声波辅助酶法作为一种新兴的提取技术，已经被应用于果胶的提取工艺优化中，并取得了较好的效果。

1.3.2 双翅六道木果胶的应用前景

双翅六道木果胶在食品工业中可能具有作为增稠剂、稳定剂和凝胶剂的潜力。
双翅六道木果胶在医药领域具有潜在的应用价值，如降低胆固醇、调节血糖、增强免疫力等。
双翅六道木果胶在化妆品行业中可用作保湿剂和乳化剂，锁住水分，使皮肤保持湿润和光滑。
双翅六道木果胶在环保和生物材料领域也具有潜在的应用价值，如制作可降解的生物塑料和包装材料。

1.4 本研究的目的与意义

此项研究旨在通过超声波和酶法技术的结合来提取双翅六道木果胶，并分析果胶的化学组成及物理表征，为该该果胶的工业生产和实际使用提供一定理论依据。

2. 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 原材料

双翅六道木嫩叶：采自湖南省隆回县金石桥镇。

2.1.2 试剂

草酸铵溶液、纤维素酶、乙醇、KBr、盐酸溶液、半乳糖醛酸、浓硫酸、三氟乙酸、吡啶、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺等。

2.2 主要仪器设备

SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机、予华牌循环水式真空泵（SHZ-DⅢ）、电热恒温水浴锅（DZKW）、电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9246A、Micro21/21R台式高速冷冻离心机、LGJ-18C真空冷冻干燥机、FTIR-8400S傅里叶红外光谱仪、Gemini-SEM300蔡司扫描电镜、8860 5977b 气质联用仪等。

2.3 实验方法

2.3.1 原料的预处理

将鲜叶用清水彻底清洗，以消除其上的尘土、沙粒、泥土等杂质，然后清洗后鲜叶摊开，自然晾干。
最后晾干后鲜叶用粉碎机粉碎，过60目备用。

2.3.2 果胶提取

参考王晓梅、李明[15]的测定方法，取8 g双翅六道木叶粉末于烧杯中，以1:60（g:mL）的料液比加入6 g/L草酸铵溶液。
设置超声功率为600 W（3 s开，3 s关），超声时间为20 min。
将处理后的样液离心(10000 r/min，10 min)，抽滤分离上清液与双翅六道木渣。
取双翅六道木渣于烧杯中，加入0.4%（质量分数）的纤维素酶，以1:30（g:mL）的料液比加入6 g/L的草酸铵溶液，60℃下搅拌40 min。
沸水浴灭酶5 min。
将样液离心(10000 r/min，5 min)，抽滤，将其上清液与超声处理得到的上清液混合后，加入混合液4倍体积的乙醇，4℃下静置12 h。
通过离心机将混合液进行离心分离，去除其中的固体残渣和杂质，得到果胶提取液。
醇沉后将混合物抽滤后，用少量乙醇、纯水先后洗涤果胶，然后将提取果胶冷冻干燥3 d，取出称重，计算提取率。

2.3.3 果胶含水量测定

依据GB5009.3-2016《食品安全卫生国家标准食品中水分的测定》的规定。

2.3.4 果胶中酸不溶性灰分测定

精确称取1至2 g（精确至0.01g）的果胶样品，随后使用小火逐步加热，直至样品完全炭化。
将此炭化物放入高温炉中，在550℃至600℃的温度范围内进行灼烧，直至达到恒重状态。
灼烧结束后，收集到的残渣放入一个容量为50 mL的烧杯里，并逐渐加入20 mL的盐溶解液液。
将混合物加热至沸腾，处理5 min。
为了移除不纯物质，我们采用了一个恒重的砂芯漏斗进行了过滤，并在多次热水洗涤后确保滤液中不再残留氯离子。
将洗涤后的残渣置于105℃的干燥箱中，持续烘干直至再次达到恒重状态。
最后根据公式（2）计算酸不溶性灰分的含量。

2.3.5 蛋白含量测定

参考王孝平、邢树礼[16]的测定方法并加以改进。
首先用牛血清白蛋白配置成100 mg/mL标准溶液，然后称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL的95%的乙醇中，再加入100 mL 85%的磷酸，最后用超纯水稀释至1 L，混合均匀，备用。
准备6支试管，5支分别加入0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL浓度为100 μg/mL牛血清清蛋白标准液，向试管中加入超纯水至1.0 mL，一支试管加入1.0 mL蒸馏水做空白。
然后分别向6支试管加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡均匀，并在室0温下静置30 min。
最后再595 nm处测定每支试管混合液的吸光度值，并绘制蛋白的标准曲线。
取1 mL浓度为0.05 mg/mL的待测物溶液加入试管中，另一支试管加入1.0 mL蒸馏水作空白对照。
然后分别在两支试管加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡均匀，在室温下静置30 min后，最后在595 nm处测定其吸光度值。
根据蛋白的标准曲线，计算出果胶中的蛋白含量。

2.3.6 pH值的测定

配制0.1%果胶溶液，直接用pH计测。

2.3.7 半乳糖醛酸含量测定

标准曲线的绘制流程如下：首先，使用电子天平精确称取约0.1g的半乳糖醛酸，并完全溶解于100ml的蒸馏水中，从而得到半乳糖醛酸的标准溶液。
接着，从该标准溶液中分别移取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL至10 mL的容量瓶中，通过加水定容，得到一系列质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液。
然后，取6支50 mL的比色管，分别加入1mL上述不同浓度的标准溶液，并沿管壁缓慢注入6 mL的浓硫酸，小心混合均匀后，置于100℃水浴中加热20 min。
待冷却至常温后，向每支比色管中加入0.5 mL的0.15%咔唑-乙醇溶液，并轻轻摇匀，使其在暗处显色60 min。
最后，使用分光光度计在528 nm波长处测定各溶液的吸光度，并以吸光度为纵坐标（y），对应的半乳糖醛酸质量浓度为横坐标（x），绘制出标准曲线。
制备0.15%咔唑无水乙醇溶液时，首先称取0.15g咔唑置于烧杯中，随后加入适量的乙醇进行溶解，最终将溶液定容至100 mL的容量瓶中，以备后续实验使用。
果胶含量的测定，首先需配制1 mg/mL的样品溶液。
然后，参照（1）中所述的方法，测定该样品溶液的吸光度，并重复测量3次以获取更准确的数据，最后取三次测量的平均值作为最终结果。

2.3.8 傅里叶红外光谱

取少量果胶粉，加入KBr混合，充分研磨压片，在4000-400cm-1范围内扫描样品的傅里叶红外光谱，记录光谱图。

2.3.9 分子量测定

取10g样品首先经过6小时110℃的三氟乙酸水解，之后利用旋蒸技术去除三氟乙酸。
接着进行衍生化处理：将水解样品移至样品瓶，加入吡啶并加热至80℃溶解，再加入N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺继续80℃反应1h，冷却后通过0.43 μm滤膜过滤准备进样。
采用安捷伦8860 5977b气质联用仪，配合HP-5ms色谱柱，以及特定的进样条件如0.2 μL进样量、280℃进样口温度、20:1分流比等参数进行分析。
色谱程序包括多个温度阶段，质谱条件则涵盖EI离子源、230℃离子温度等设定，并使用NIST谱库比对结果。

2.3.10 扫描电镜

取适量干燥的果胶粉末用双面导电胶粘附在SEM样品台上，喷金后观察果胶微观形态并使用电镜扫描拍照，加速电压为20 kV，放大倍数分别为500倍和1000倍。

2.3.11 DPPH自由基清除率

参照文献的方法并适当调整。
取双翅六道木果胶样品1 mL，然后加入0.04 mg/mL DPPH乙醇溶液2 mL，摇匀，静置30 min后在波长517 nm处测定吸光度Ai，同时以无水乙醇1 mL代替样品为空白对照，在波长517 nm处测定吸光度A0。
DPPH自由基清除率公式如下。

2.3.12 羟自由基清除率

取1 mg/mL的双翅六道木果胶样品与6 mmol/L的FeSO4 mL及6 mmol/L的H2O2溶液各1 mL加入试管中，混匀后静置10 min再加入由无水乙醇配制的6mmol/L水杨酸1 mL，测试在510 nm下各组的吸光值。
式中：A1—样品吸光值；A2—蒸馏水代替水杨酸吸光值；A0—蒸馏水代替样品吸光值。

3. 结果与分析

3.1 果胶化学成分分析

3.1.1 提取率

超声波辅助酶法提取双翅六道木果胶的提取率为23.38%，与传统提取方法相比，提取率更高，同时极大的减少了提取果胶所需要的时间。

3.1.2 干燥减量

干燥减量为10.52%，此指标反映了果胶中的水分含量，10.52%低于GB25533-2010的要求，较低的干燥减量可以说明该果胶样品更加干燥。

3.1.3 酸不溶性灰分

酸不溶性灰分为0.94%，低于GB25533-2010的要求，酸不溶性灰分是果胶中无机杂质的指标，较低的含量表示果胶样品纯度较高。

3.1.4 蛋白含量

蛋白含量为1.10%，果胶中的蛋白质含量反映了其可能的杂质水平，较低的蛋白含量有利于果胶在食品、医药等领域的应用。

3.1.5 pH值

pH值为5.03，此指标提供了果胶溶液的酸碱度信息，对于了解果胶的稳定性和功能性有重要意义。

3.1.6 半乳糖醛酸含量

双翅六道木果胶的单糖成分中，半乳糖醛酸（GalA）的占比最高，具体达到了72.16%。
此外，其还包含诸如葡萄糖（Glc）、L-鼠李糖（Rha）、D-半乳糖（Gal）、L-阿拉伯糖（Ara）和岩藻糖（Fuc）等主要的中性单糖。
果胶的结构可以被细分为几个部分，包括同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ（RG-Ⅰ）以及鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RG-Ⅱ）。

3.2 傅里叶红外光谱分析

3.2.1 吸收峰的解析

3417cm-1位置的吸收峰代表了O-H键的伸缩振动，2928cm-1位置的吸收峰与C-H键的伸缩振动相对应，1642cm-1位置的峰与游离的羧基基团及C=O键相关。
1276cm-1处存在一个较弱的吸收峰，这暗示了糖醛酸的存在，因为它是由C=O键的伸缩振动所引起的。
1065cm-1位置的峰与-C-O-C糖苷键的振动相对应，同时涉及C=O在COOH中的伸缩以及O-H的弯曲。
1400~700cm-1范围内的多个较弱的吸收峰，这些是由C-H弯曲振动所引起的，这一光谱特征与双翅六道木嫩叶中的果胶多糖样品是一致的。