甘薯根际细菌多样性及功能研究

1. 研究背景与意义

1.1 甘薯在农业与全球粮食安全中的作用

1.1.1 甘薯的生态适应性与高产量特性

• 甘薯在全球范围内广泛种植，尤其是在热带和亚热带地区。
• 甘薯具有较强的生态适应性，能在各种环境中生长，并且产量高。
• 甘薯块根含有丰富的胡萝卜素、维生素B、维生素C以及铁和钙等矿物质，具有预防癌症和降血压等功能。

1.1.2 甘薯在农业可持续发展中的重要性

• 甘薯是投入少、产出多、抗旱耐瘠的作物，对维护全球粮食安全具有重要意义。
• 甘薯在粮食危机中扮演着重要角色，是全球粮食安全的一颗耀眼新星。
• 甘薯生产效率和品质受多种因素影响，其中土壤微生物是其中一个关键因素。

1.2 根际细菌在植物生长中的作用

1.2.1 根际细菌的定义与功能

• 根际细菌是指在植物根际区域存在的细菌。
• 根际细菌能够活化土壤中难溶性矿物质，转化为植物可吸收的形式。
• 根际细菌通过固氮、溶磷、产生植物激素等功能，促进植物根系对矿质元素的吸收效率。
• 根际细菌对植物根系的生长和发育产生深远影响，确保植物的健康生长和产量提升。

1.2.2 根际细菌与土壤肥力

• 根际细菌来源于土壤，受到植物根系分泌物的筛选和招募、以及土壤理化因素的调控。
• 根际细菌对土壤肥力及健康有着不可忽视的作用，是土壤微生物的重要组成部分。
• 根际细菌通过协同作用，共同维持着植物根际环境的生态平衡，对植物生长和产量具有重要影响。

1.3 长期施肥对土壤微生物的影响

1.3.1 化肥与有机肥的比较

• 长期施用化肥会导致土壤酸化和板结，减少土壤细菌多样性。
• 施用有机肥，如作物残茬和畜禽粪便，是改善细菌多样性和农业生产力的有效、环保策略。
• 有机肥能够增加土壤中有益微生物的种类和数量，改善土壤微生物的多样性。

1.3.2 不同施肥处理对甘薯根际细菌的影响

• 本研究选择长期（16年）施用化肥和不同有机肥处理，分析化肥处理和不同有机肥处理的甘薯根际细菌多样性。
• 研究发现，化肥配施猪粪有助于维持土壤细菌群落丰富度和多样性，且化肥配施猪粪效果最好。
• BugBase表型预测结果表明，化肥配施猪粪的革兰氏阳性菌丰度较高、革兰氏阴性菌丰度较低。

2. 研究方法

2.1 材料与方法

2.1.1 试验材料

• 本试验所用土壤为江苏省农业科学院环境与资源所土壤肥力团队实验室提供。
• 试验地点位于中国莆田市笏石镇，开始于2007年。

2.1.2 试验药品与仪器设备

• 所使用的药品主要包括乙醇、蔗糖、肉汤、琼脂、量杯等。
• 使用的仪器设备有高压灭菌锅、超净台、培养箱、酶标仪、紫外分光光度计等。

2.1.3 培养基及试剂

• 固氮培养基、解磷培养基、解钾培养基、淀粉酶培养基、纤维素酶培养基、YN培养基等。

2.2 方法

2.2.1 土壤DNA提取、高通量测序和生物信息学分析

• 使用PowerSoil分离试剂盒从0.50 g土壤中提取总DNA。
• 采用引物338F和806R扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。
• 使用Illumina MiSeq PE 300测序平台分析细菌群落。

2.2.2 细菌平板分离

• 称取5 g土壤，放进50ml无菌生理盐水的密封三角瓶内，放进摇床摇30分钟，沉淀五分钟，得到10-1梯度滤液，进行梯度稀释。
• 选取10-3、10-4、10-5个梯度，各取稀释液100μL，涂到LB固体培养基上，在培养箱里培养两天。
• 培养好后再对细菌进行提纯，最后用甘油保藏。

2.2.3 细菌功能鉴定

• 利用平板进行计数的方法。
• 采用培养基的分离技术，为分离和识别土壤中的细菌、放线菌以及其他微生物，需要准备特定的培养基。
• 生化鉴定：通过测量土壤中特定酶的活性或对某些底物的利用情况来鉴定细菌的功能。

2.2.4 细菌16S rRNA序鉴定

• 提取细菌基因组DNA，采用原核生物16S rRNA通用引物进行PCR扩增。
• 将测得的16S rRNA 序列提交NCBI Genbank进行Blast同源性比对分析。

2.2.5 有机肥处理甘薯根际细菌功能分析

• 固氮能力测定、解磷能力测定、产吲哚乙酸（IAA）能力测定、产铁载体能力测定、产淀粉酶能力测定、产纤维素酶能力测定等。

2.3 数据处理分析

2.3 数据处理分析

• 使用Microsoft Excel 2021录入数据并计算。
• 使用SPSS 25.0进行统计分析。
• 利用独立样本t检验（Student's t-test）对两组数据进行统计分析。
• 利用单因素方差分析（one-way ANOVA）对两组以上数据进行统计分析。
• 利用Origin2021和Ai进行图像处理。

3. 结果与分析

3.1 长期施肥对植薯土壤细菌群落及功能的影响

3.1.1 长期施肥对细菌Alpha多样性的影响

• 与长期不施肥相比，长期仅施化肥降低Sob、Chao和ACE指数，表明仅施化肥降低植薯土壤细菌物种丰富度。
• NPK处理降低Shannon指数、增加 Simpson指数，表明仅施化肥降低植薯土壤细菌群落多样性。

3.1.2 长期施肥对细菌群落结构的影响

• 长期施肥对细菌群落组成的影响进行主坐标（PCoA）分析。
• 长期施肥显著影响植薯土壤细菌群落结构，NPK、NPK+CM、NPK+RS处理细菌群落结构较相似，这三个处理、CK、NPK+PM细菌群落结构相差较大。

3.1.3 长期施肥对细菌门水平的相对丰度

• NPK、NPK+CM、NPK+RS均增加变形菌门和厚壁菌门丰度；NPK+PM降低绿弯菌门丰度。

3.1.4 长期施肥对细菌属水平的相对丰度

• NPK、NPK+CM、NPK+RS处理细菌丰度更相似，CK、NPK+PM处理细菌丰度更为相似。

3.1.5 长期施肥对细菌表型和功能的影响

• BugBase表型预测结果表明，CK、NPK+PM处理的革兰氏阴性菌G+丰度较低、而革兰氏阳性菌G-丰度较高。

3.1.6 有机肥处理甘薯根际细菌分离和鉴定

• 利用稀释平板法，进行可培养细菌计数。
• 从化肥配施猪粪处理分离获得68株形态不同的细菌。

3.2 有机肥处理甘薯根际细菌功能分析

3.2 有机肥处理甘薯根际细菌功能分析

• 利用相应的培养基对细菌的功能进行分析，包括固氮、解磷、解钾、产IAA、产铁载体、产淀粉酶、产纤维素酶等。

3.3 菌株综合评价及优选菌株鉴定

3.3 菌株综合评价及优选菌株鉴定

• 综合考虑细菌固氮、解磷、解钾、产IAA、产铁载体、产淀粉酶、产纤维素酶的某一功能和综合功能，筛选出10个优选菌株。

3.4 选择不同功能、不同类别的细菌，构建合成群落

3.4 选择不同功能、不同类别的细菌，构建合成群落

• 对优选菌株进行一对一的对峙试验。
• 构建1个含10个菌株的合成群落。
• 将单个菌株活化、1:1配比，构建合成群落Syncom并回接至甘薯根部，培养一个月之后，进行根系形态分析。

4. 讨论

4.1 甘薯根际细菌多样性与功能的关系

4.1 甘薯根际细菌多样性与功能的关系

• 根际细菌的种类和数量不是一成不变的，不同环境如季节、温度、土壤含水量等、不同发育期的植物根际微生物的种类和数量也存在很大差异。
• 研究表明，细菌多样性对甘薯的健康与产量具有显著影响。
• 丰富的细菌种群能够提供更全面的土壤功能，如养分循环、病害防治等，从而有助于增强甘薯的养分吸收和抗逆能力，从而提高产量。

4.2 长期施肥对甘薯根际细菌的影响

4.2 长期施肥对甘薯根际细菌的影响

• 长期施用化肥会导致土壤酸化和板结，减少土壤细菌多样性。
• 施用有机肥，如作物残茬和畜禽粪便，是改善细菌多样性和农业生产力的有效、环保策略。
• 有机肥能够增加土壤中有益微生物的种类和数量，改善土壤微生物的多样性。

4.3 优选菌株的筛选与合成群落的构建

4.3 优选菌株的筛选与合成群落的构建

• 通过筛选具有不同功能的优选菌株，构建合成群落，可以更有效地改善甘薯的生长状况，提高产量和品质。
• 合成群落中的细菌通过协同作用，共同维持着植物根际环境的生态平衡，对植物生长和产量具有重要影响。

5. 结论

• 本研究通过长期施肥试验，分析了化肥处理和不同有机肥处理的甘薯根际细菌多样性，并对其功能进行了预测。
• 研究发现，长期化肥配施猪粪能够维持甘薯根际细菌群落的丰富度和多样性，并且维持有益微生物如放线菌门的丰度以及细菌的胁迫耐受能力。
• 通过筛选具有不同功能的优选菌株，构建合成群落，可以更有效地改善甘薯的生长状况，提高产量和品质。

参考文献

[1] 刘宗云, 甘薯的起源、传播和驯化[J]. 植物学报, 2002, 37(4): 387-393. [2] 王京, 甘薯[M]. 北京: 中国农业出版社, 2004. [3]