免疫细胞的检测

1. 免疫细胞的分离

1.1 密度梯度离心法

• 密度梯度离心法是体外分离外周血单个核细胞（PBMC）的常用方法。
• 聚蔗糖（ficoll）和泛影葡胺（hypaque）配成的淋巴细胞分离液近于等渗，将抗凝的外周血叠加于 ficoll-hypague 分离液上层，经低速离心后，ficoll-hypaque 分离液可将不同密度的血细胞分层。
• PBMC（主要淋巴细胞与单核细胞）由于密度稍低于分离液，位于分离液的界面与血浆层之间。
• 吸出这一层的细胞即可获得PBMC。

1.2 磁激活细胞分选法(MACS)

• 磁性微珠在液相中，受外加磁场的吸引作用，可吸附在磁性介质上，以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。
• 原理:将特异性抗细胞表面抗原的抗体结合到磁珠上，形成免疫磁珠，与PBMC中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与磁珠结合的细胞与其他细胞分离，达到分离、纯化淋巴细胞的目的。
• 阳性分离法:采用针对所要获取细胞表面某种抗原的免疫磁珠，与PBMC反应后，收集与磁珠结合的细胞
• 阴性分离法：采用针对细胞表面抗原的免疫磁珠去除不需要的细胞，收集不和免疫磁珠结合的细胞即为所要获取的目的细胞。

1.3 流式分选法（FCM）

• 流式细胞术是采用荧光激活细胞分选仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）对细胞进行快速鉴定和分类的技术。
• 原理：在对细胞进行各种荧光分析测定之后，使液体流束形成含有细胞的带电液滴，这些液滴通过恒定的电场时将根据自身所带的电荷性质发生偏转，进入两侧的收集管中，而不带电荷的液滴则直接落人废液收集管中，从而实现对细胞的分选。
• 优点：流式细胞术分离细胞准确快速，分选纯度高，不损伤细胞活性，并可直接统计出各类细胞的相对含量。

1.4 抗原肽-MHC分子四聚体技术

• 抗原肽-MHC分子四聚体技术是定量检测抗原特异性细胞的有效方法。
• T细胞表面的T细胞受体（TCR）可特异性识别、结合抗原提呈细胞或靶细胞表面的MHC-抗原肽复合物并在共刺激分子的作用下介导T细胞活化。
• 在体外制备 MHC-抗原肽复合物，通过与T细胞的TCR特异性结合就可以达到直接检测抗原特异性T细胞的目的。
• 改进：MHC-肽复合物单体与TCR的亲和力低，解离率高，无法实际应用。借助生物素-亲和素放大系统，即将生物素标记的MHCI类分子-肽复合物单体与荧光标记的亲和素结合，1个荧光标记的亲和可以结合4个生物素标记的MHCI类分子-肽复合物单体，从而形成四聚体，抗原肽-MHC分子四聚体可以与抗原特异性T细胞表面的TCR结合，从而通过流式细胞仪可进行分离鉴定或定量分析。
• 该方法广泛应用于感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫病的研究中。

2. 免疫细胞的功能检测

2.1 T细胞功能检测

• 体外引起T细胞活化，活化后的T细胞发生增殖。
• 淋巴母细胞细胞特征：细胞体积变大、胞质增多、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松，且能进行分裂。

2.1.1 增殖试验

• 3H-胸腺嘧啶掺入法
  • 优点：灵敏度高，结果可靠。
  • 缺点：存在放射性核素污染和需要特殊的仪器。
• MTT法
  • 优点：操作简便，且无放射性污染。
  • 缺点：灵敏度较低。

2.1.2 混合淋巴细胞反应

• 常用于器官移植前的组织配型，以测定受者和供者主要组织相容性抗原的相容程度。

2.2 B细胞功能检测

• 体外检测B细胞抗体生成能力和计数抗体生成细胞的方法为溶血空斑试验（hemolytic plaque assay ）。

2.3 细胞毒实验

• CTL、NK细胞、LAK细胞、TL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒作用，通过检测效应细胞溶解、破坏靶细胞的能力可以反映效应细胞的功能状态。

2.3.1 51Cr释放法

• 优点：结果准确，重复性好。
• 缺点：敏感性较低，还存在放射性污染。另外 51Cr 的半衰期短（27.8d），无法用于需多次测定的动物实验。

2.3.2 乳酸脱氢酶（LDH）释放法

• 优点：操作快捷，自然释放率低。
• 缺点：由于LDH相对分子质量较大，在靶细胞严重破损时才能被释放出来，所以不能较早反映效应细胞的功能。

2.4 细胞凋亡检测

• 琼脂糖电泳法
• TUNEL 检测( terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL Assay)法
• 流式细胞术
  • 优点：染色时间短，检测速度快，对细胞活性影响不大。

2.5 细胞因子检测

• 生物活性检测法
• 免疫学检测法
• 分子生物学检测法
• 流式细胞术检测法