灭菌技术在发酵工业中的应用

1. 灭菌的重要性

1.1 灭菌的定义与作用

1.1.1 灭菌的定义

• 灭菌是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。
• 灭菌是保证发酵过程中微生物纯度的重要手段，对产品的产量和质量有着决定性的影响。

1.1.2 灭菌在发酵过程中的作用

• 引入灭菌在发酵过程中的作用和必要性。
• 举例说明未经灭菌的风险和可能导致的问题。
• 灭菌可以防止杂菌污染，确保发酵过程的顺利进行，提高产品纯度和产量。

1.2 灭菌方法概述

1.2.1 高压蒸汽灭菌

• 利用高压饱和蒸汽进行灭菌，通常在121℃下持续15至20分钟。
• 常用设备为高压蒸汽灭菌器（Autoclave），可以灭菌布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液。
• 优点：穿透力强，灭菌效率高，成本相对较低。
• 缺点：对热敏感物品不适用，可能导致某些物品的变形或损坏。

1.2.2 干热灭菌

• 利用干热空气在160℃至170℃下持续2小时以上进行灭菌。
• 常用设备为干热灭菌箱（Dry Heat Sterilizer），主要用于不便在高压蒸汽灭菌器中进行灭菌的物品，如玻璃器皿、金属器械等。
• 优点：对金属和锋利的仪器无腐蚀性，适用于不耐湿热的物品。
• 缺点：热渗透速度慢，杀菌时间长，高温不适合大多数材料。

1.2.3 化学灭菌

• 使用化学消毒剂形成的气体，如乙炔、过氧化氢和氯化物，进行灭菌。
• 用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、某些实验器皿等。
• 优点：穿透力强，杀菌谱广，对物品损伤轻，物品保存期长，灭菌效果肯定，费用低廉。
• 缺点：易燃易爆，储存和灭菌时绝对不能泄露，对操作人员存在潜在危险性。

1.2.4 紫外灭菌

• 利用紫外线进行照射灭菌。
• 紫外线杀菌器（UV Sterilizer）：适合于实验室空气、地面、操作台面的灭菌。

1.2.5 过滤除菌

• 将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，阻留大于滤膜孔径的细菌，达到除菌目的。
• 常用设备为过滤除菌器（Filtration Sterilizer），通过有微孔的滤膜过滤液体或气体，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌。
• 优点：操作简单、灭菌效果好、不会破坏培养物中的成分，可以得到纯净的微生物菌种。
• 缺点：过滤膜的价格较高，而且过滤器需要定期更换，使用成本较高。

1.3 培养基灭菌分类与方法

1.3.1 实罐灭菌

• 将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，一般119～121℃，搅拌并保温30min左右，再冷却到接种温度。
• 优点：无需专门的灭菌设备，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低，一般 0.2~0.3 MPa(G)
• 缺点：灭菌过程中蒸汽高峰负荷大，造成锅炉负荷波动大，而且灭菌时间长，对培养基成份破坏较大，在工业生产中难以实现自动控制。

1.3.2 连续灭菌

• 将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程。
• 优点：在更高的温度下灭菌，缩短保温时间，可以减少对培养基营养成分的破坏。
• 缺点：但对蒸汽的稳定性和压力参数要求较高，一般大于0.6 MPa(G)，设备操作也较复杂。

1.3.3 连续灭菌对培养基灭菌的控制

• 培养基的粘度大、颗粒度大可能影响培养基传热系数及设备，从而在热灭菌时造成受热不均导致灭菌不彻底或堵塞管路。
• 培养基中含有不同种性质的营养成分时，在连续灭菌时可能造成对不耐热营养成分的返混和部分灭菌不透彻，对脂肪、糖分和蛋白质的含量越高的培养基，微生物的热死亡速率较一般培养基慢。

1.4 详细的灭菌流程

1.4.1 准备

• 选择合适的灭菌方法：根据物品的性质和要求，选择适当的灭菌方法，如湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌或化学消毒。
• 清洁物品：在灭菌前，确保物品表面干净，去除污垢和有机物。
• 准备灭菌设备：根据所选的灭菌方法，准备好相应的灭菌设备，如高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱或辐射设备。

1.4.2 处理

• 装载物品：将需要灭菌的物品放入灭菌设备中，注意不要过度填充，以免影响灭菌效果。
• 设置灭菌参数：根据灭菌设备的要求，设置温度、压力和时间等参数。
• 启动灭菌程序：开始灭菌过程。

1.4.3 监控

• 温度和压力监测：在灭菌过程中，定期监测设备的温度和压力，确保其稳定在设定值范围内。
• 记录数据：记录灭菌过程中的关键数据，如开始时间、结束时间、温度和压力变化等。

1.4.4 验证

• 生物指示物验证：使用生物指示物（如孢子悬液）来验证灭菌效果。将生物指示物放入灭菌设备中，然后培养并检查是否有生长。
• 物理指标验证：验证物理指标，如温度、压力和时间是否达到灭菌要求。
• 记录验证结果：记录验证结果，确保灭菌程序有效。

1.5 案例研究

1.5.1 案例概述

• 设计某原料药发酵车间中，发酵罐公称容积为 300 m3 ，为分批发酵。
• 为保证培养基的快速充分灭菌，选用连消塔加热螺旋板换热器冷却连消工艺进行灭菌。

1.5.2 设计参数

• 发酵罐体积——>培养基流量——>灭菌温度、换热器种类、进入发酵罐温度
• 公用工程消耗量计算：连消塔、连消泵、维持罐的选择和耗能的初步计算，蒸汽及冷却水耗量计算

1.5.3 工艺流程改进

• 《不同灭菌方式对螺旋藻及其发酵后营养功效成分的影响》一文中利用高温蒸汽灭菌、超高压灭菌和紫外线灭菌三种方式,结合乳酸菌发酵,比较分析不同灭菌方式下螺旋藻发酵前后上清液和固形物中营养功效以及过夜放置后污染程度，由实验数据得出最适合对螺旋藻发酵产品的灭菌方式。
• 说明具体灭菌方式的选择仍然需要实验试验结构的支撑。

1.6 灭菌的监控和质量控制

1.6.1 生物指示剂的应用

• 生物指示剂是一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能，灭菌程序的验证，生产过程灭菌效果的监控等。
• 在灭菌程序验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被灭杀程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的的指标。

1.6.2 灭菌质量控制的重要性

• 灭菌质量控制是确保发酵过程顺利进行和产品质量的关键环节。
• 通过生物指示剂的验证和灭菌参数的监控，可以及时发现并解决灭菌过程中出现的问题，确保灭菌效果。

1.7 未来趋势和技术发展

1.7.1 低温等离子体消毒灭菌技术

• 等离子体定义：等离子体是由离子、电子和中性粒子（原子和分子）、活性自由基和紫外线等组成的集合体，被称为物质的第四态。
• 低温等离子体（LTP）：在非热平衡态下，电子的温度很高，而离子和原子等重粒子温度较低的等离子体称为低温等离子体。
• LTP的产生：LTP可以通过电晕放电、介质阻挡放电和大气压等离子体射流等方法产生。
• 杀菌效果：LTP对细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、病毒及细菌和真菌毒素都有良好的杀灭效果。
• 杀菌机制：LTP杀菌的机制包括物理化学作用和细胞生物学作用，如紫外线照射、带电粒子与电场的影响，以及破坏微生物外部结构和影响生物大分子正常生理功能。
• LTP 空气消毒器可处理大风量空气中的微生物气溶胶，在气流通过反应器的瞬间将微生物密度降低数个数量级，有广泛的工业应用前景。然而，空气放电